大鼠基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）酶聯免疫

      檢測試劑盒使用說明書         

使用前仔細閱讀本說明書╃☁✘╃✘。本酶聯免疫試劑盒是基於雙抗體夾心技術原理✘·，來檢測大鼠基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）✘·，只能用於研究用途✘·，不得用於醫學診斷╃☁✘╃✘。

用    途│││：用於大鼠血清☁✘✘·•、血漿及相關液體樣本中基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）測定╃☁✘╃✘。

工作原理

本試劑盒採用的是生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定樣品中大鼠基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）水平╃☁✘╃✘。向預先包被了大鼠基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）單克隆抗體的酶標孔中加入大鼠基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）✘·，溫育；溫育後✘·，加入生物素標記的抗基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體╃☁✘╃✘。再與鏈黴親和素-HRP結合✘·，形成免疫複合物✘·，再經過溫育和洗滌✘·，去除未結合的酶✘·，然後加入底物A☁✘✘·•、B✘·，產生藍色✘·，並在酸的作用下轉化成終的黃色╃☁✘╃✘。顏色的深淺與樣品中大鼠基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）的濃度呈正相關╃☁✘╃✘。

試劑盒組成 

需要而未提供的試劑和器材│││：

• 37℃恆溫箱
• 標準規格酶標儀
• 精密移液器及一次性吸頭
• 蒸餾水
• 一次性試管
• 吸水紙

注意事項│││：

• 從2-8℃取出的試劑盒✘·，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘╃☁✘╃✘。酶標包被板開封后如未用完✘·，板條應裝入密封袋中儲存╃☁✘╃✘。
• 各步加樣均應使用加樣器✘·，並經常校對其準確性✘·，以避免試驗誤差
• 嚴格按照說明書的操作進行✘·，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
• 為避免交叉汙染✘·，要避免重複使用手中的吸頭和封板膜╃☁✘╃✘。
• 不用的其它試劑應包裝好或蓋好╃☁✘╃✘。不同批號的試劑不要混用╃☁✘╃✘。保質前使用╃☁✘╃✘。
• 底物B對光敏感✘·，避免長時間暴露於光下╃☁✘╃✘。

洗板方法│││：

1.手工洗板方法│││：甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙✘·，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋後的洗滌液至少0.35ml注入孔內✘·，浸泡1-2分鐘╃☁✘╃✘。根據需要✘·，重複此過程數次╃☁✘╃✘。

2.自動洗板│││：如果有自動洗板機✘·，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中

標本要求│││： 

1．不能檢測含NaN3的樣品✘·，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性╃☁✘╃✘。

2．標本採集後儘早進行提取✘·，提取按相關文獻進行✘·，提取後應儘快進行實驗╃☁✘╃✘。若不能馬上進行試驗✘·，可將標本放於-20℃儲存✘·，但應避免反覆凍融╃☁✘╃✘。

操作程式│││：

• 標準品的稀釋│││：(本試劑盒提供原倍標準品一支✘·，使用者可按照下列圖表在小試管中進行稀釋╃☁✘╃✘。)

• 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數╃☁✘╃✘。每個標準品和空白孔建議做復孔╃☁✘╃✘。每個樣品根據自己的數量來定✘·，能使用復孔的儘量做復孔╃☁✘╃✘。
• 加樣│││：1）空白孔✘·，空白對照孔不加樣品✘·，生物素標記的抗MMP-2抗體✘·，鏈黴親和素-HRP✘·，只加顯色劑A&B和終止液✘·，其餘各步操作相同；2）標準品孔│││：加入標準品50ul✘·，鏈黴親和素-HRP50ul(標準品中已事先整合好生物素抗體✘·，故不加)；3）待測樣品孔│││：加入樣本40ul✘·，然後各加入抗MMP-2抗體10ul☁✘✘·•、鏈黴親和素-HRP50ul✘·，蓋上封板膜✘·，輕輕震盪混勻✘·，37℃溫育60分鐘╃☁✘╃✘。
• 配液│││：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋後備用╃☁✘╃✘。
• 洗滌│││：小心揭掉封板膜✘·，棄去液體✘·，甩幹✘·，每孔加滿洗滌液✘·，靜置30秒後棄去✘·，如此重複5次✘·，拍幹╃☁✘╃✘。
• 顯色│││：每孔先加入顯色劑A50ul✘·，再加入顯色劑B50μl✘·，輕輕震盪混勻✘·，37℃避光顯色15分鐘. 
• 終止│││：每孔加終止液50μl✘·，終止反應（此時藍色立轉黃色）╃☁✘╃✘。
• 測定│││：以空白空調零✘·，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）╃☁✘╃✘。 測定應在加終止液後10分鐘以內進行╃☁✘╃✘。
• 根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線迴歸方程✘·，再根據樣品的OD值在迴歸方程上計算出對應的樣品濃度╃☁✘╃✘。也可以使用各種應用軟體來計算╃☁✘╃✘。

操作程式總結│││：

試劑盒效能│││：

1.樣品線性迴歸與預期濃度相關係數R值為0.92以上╃☁✘╃✘。

2.批內與批間應分別小於9%和15%

檢測範圍│││：

檢測範圍│││：20μg/L -480μg/L

儲存條件及有效期│││：

儲存│││：2-8℃╃☁✘╃✘。

有效期│││：6個月(2-8℃)╃☁✘╃✘。