大鼠血管內皮細胞蛋白C受體（EPCR）酶聯免疫

        檢測試劑盒使用說明書         AE94378Ra

   使用前仔細閱讀本說明書✘✘·。本酶聯免疫試劑盒是基於雙抗體夾心技術原理╃☁✘✘☁，來檢測大鼠血管內皮細胞蛋白C受體（EPCR）╃☁✘✘☁，只能用於研究用途╃☁✘✘☁，不得用於醫學診斷✘✘·。

用        途₪☁₪◕•：用於大鼠血清•₪•·、血漿及相關液體樣本中血管內皮細胞蛋白C受體（EPCR）測定✘✘·。

工作原理:

   本試劑盒採用的是生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定樣品中大鼠血管內皮細胞蛋白C受體（EPCR）水平✘✘·。向預先包被了大鼠血管內皮細胞蛋白C受體（EPCR）單克隆抗體的酶標孔中加入大鼠血管內皮細胞蛋白C受體（EPCR）╃☁✘✘☁，溫育；溫育後╃☁✘✘☁，加入生物素標記的抗血管內皮細胞蛋白C受體（EPCR）抗體✘✘·。再與鏈黴親和素-HRP結合╃☁✘✘☁，形成免疫複合物╃☁✘✘☁，再經過溫育和洗滌╃☁✘✘☁，去除未結合的酶╃☁✘✘☁，然後加入底物A•₪•·、B╃☁✘✘☁，產生藍色╃☁✘✘☁，並在酸的作用下轉化成終的黃色✘✘·。顏色的深淺與樣品中大鼠血管內皮細胞蛋白C受體（EPCR）的濃度呈正相關✘✘·。

試劑盒組成 

需要而未提供的試劑和器材

1. 37℃恆溫箱✘✘·。
2. 標準規格酶標儀✘✘·。
3. 精密移液器及一次性吸頭
4. 蒸餾水╃☁✘✘☁，
5. 一次性試管
6. 吸水紙

注意事項

1. 從2-8℃取出的試劑盒╃☁✘✘☁，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘✘✘·。酶標包被板開封后如未用完╃☁✘✘☁，板條應裝入密封袋中儲存✘✘·。
2. 各步加樣均應使用加樣器╃☁✘✘☁，並經常校對其準確性╃☁✘✘☁，以避免試驗誤差
3. 嚴格按照說明書的操作進行╃☁✘✘☁，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
4. 為避免交叉汙染╃☁✘✘☁，要避免重複使用手中的吸頭和封板膜✘✘·。
5. 不用的其它試劑應包裝好或蓋好✘✘·。不同批號的試劑不要混用✘✘·。保質前使用✘✘·。
6. 底物B對光敏感╃☁✘✘☁，避免長時間暴露於光下✘✘·。

洗板方法

手工洗板方法₪☁₪◕•：甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙╃☁✘✘☁，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋後的洗滌液至少0.35ml注入孔內╃☁✘✘☁，浸泡1-2分鐘✘✘·。根據需要╃☁✘✘☁，重複此過程數次✘✘·。

自動洗板₪☁₪◕•：如果有自動洗板機╃☁✘✘☁，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中

標本要求 

1．不能檢測含NaN3的樣品╃☁✘✘☁，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性✘✘·。

2．標本採集後儘早進行提取╃☁✘✘☁，提取按相關文獻進行╃☁✘✘☁，提取後應儘快進行實驗✘✘·。若不能馬上進行試驗╃☁✘✘☁，可將標本放於-20℃儲存╃☁✘✘☁，但應避免反覆凍融✘✘·。

操作程式

1. 標準品的稀釋₪☁₪◕•：(本試劑盒提供原倍標準品一支╃☁✘✘☁，使用者可按照下列圖表在小試管中進行稀釋✘✘·。)

   20μg/L	5號標準品	120μl的原倍標準品加入120μl標準品稀釋液
   10μg/L	4號標準品	120μl的5號標準品加入120μl標準品稀釋液
   5μg/L	3號標準品	120μl的4號標準品加入120μl標準品稀釋液
   2.5μg/L	2號標準品	120μl的3號標準品加入120μl標準品稀釋液
   1.25μg/L	1號標準品	120μl的2號標準品加入120μl標準品稀釋液

2. 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數✘✘·。每個標準品和空白孔建議做復孔✘✘·。每個樣品根據自己的數量來定╃☁✘✘☁，能使用復孔的儘量做復孔✘✘·。
3. 加樣₪☁₪◕•：1）空白孔╃☁✘✘☁，空白對照孔不加樣品╃☁✘✘☁，生物素標記的抗EPCR抗體╃☁✘✘☁，鏈黴親和素-HRP╃☁✘✘☁，只加顯色劑A&B和終止液╃☁✘✘☁，其餘各步操作相同；2）標準品孔₪☁₪◕•：加入標準品50ul╃☁✘✘☁，鏈黴親和素-HRP50ul(標準品中已事先整合好生物素抗體╃☁✘✘☁，故不加)；3）待測樣品孔₪☁₪◕•：加入樣本40ul╃☁✘✘☁，然後各加入抗EPCR抗體10ul•₪•·、鏈黴親和素-HRP50ul╃☁✘✘☁，蓋上封板膜╃☁✘✘☁，輕輕震盪混勻╃☁✘✘☁，37℃溫育60分鐘✘✘·。
4. 配液₪☁₪◕•：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋後備用✘✘·。
5. 洗滌₪☁₪◕•：小心揭掉封板膜╃☁✘✘☁，棄去液體╃☁✘✘☁，甩幹╃☁✘✘☁，每孔加滿洗滌液╃☁✘✘☁，靜置30秒後棄去╃☁✘✘☁，如此重複5次╃☁✘✘☁，拍幹✘✘·。
6. 顯色₪☁₪◕•：每孔先加入顯色劑A50ul╃☁✘✘☁，再加入顯色劑B50μl╃☁✘✘☁，輕輕震盪混勻╃☁✘✘☁，37℃避光顯色15分鐘. 
7. 終止₪☁₪◕•：每孔加終止液50μl╃☁✘✘☁，終止反應（此時藍色立轉黃色）✘✘·。
8. 測定₪☁₪◕•：以空白空調零╃☁✘✘☁，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）✘✘·。 測定應在加終止液後10分鐘以內進行✘✘·。
9. 根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線迴歸方程╃☁✘✘☁，再根據樣品的OD值在迴歸方程上計算出對應的樣品濃度✘✘·。也可以使用各種應用軟體來計算✘✘·。

操作程式總結₪☁₪◕•：

試劑盒效能₪☁₪◕•：

1.樣品線性迴歸與預期濃度相關係數R值為0.92以上✘✘·。

2.批內與批間應分別小於9%和15%

檢測範圍₪☁₪◕•：

檢測範圍₪☁₪◕•：0.6μg/L -22μg/L

儲存條件及有效期₪☁₪◕•：

儲存₪☁₪◕•：2-8℃✘✘·。

有效期₪☁₪◕•：6個月(2-8℃)✘✘·。