大鼠磷酸化TAU蛋白（P-TAU）酶聯免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用      

目的✘₪╃☁：

本試劑盒用於測定大鼠腦脊液☁╃，血漿及相關液體樣本中磷酸化TAU蛋白（P-TAU）含量·│✘╃。

實驗原理✘₪╃☁：

    本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠磷酸化TAU蛋白（P-TAU）水平·│✘╃。用純化的大鼠磷酸化TAU蛋白（P-TAU）抗體包被微孔板☁╃，製成固相抗體☁╃，往包被單抗的微孔中依次加入磷酸化TAU蛋白（P-TAU）☁╃，再與HRP標記的磷酸化TAU蛋白（P-TAU）抗體結合☁╃，形成抗體-抗原-酶標抗體複合物☁╃，經過*洗滌後加底物TMB顯色·│✘╃。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色☁╃，並在酸的作用下轉化成終的黃色·│✘╃。顏色的深淺和樣品中的大鼠磷酸化TAU蛋白（P-TAU）呈正相關·│✘╃。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）☁╃，透過標準曲線計算樣品中大鼠磷酸化TAU蛋白（P-TAU）濃度·│✘╃。

試劑盒組成✘₪╃☁：

樣本處理及要求✘₪╃☁：

1.血清✘₪╃☁：室溫血液自然凝固10-20分鐘☁╃，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）·│✘╃。仔細收集上清☁╃，儲存過程中如出現沉澱☁╃，應再次離心·│✘╃。

2.血漿✘₪╃☁：應根據標本的要求選擇EDTA▩▩•、者檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑☁╃，混合10-20分鐘後☁╃，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）·│✘╃。仔細收集上清☁╃，儲存過程中如有沉澱形成☁╃，應該再次離心·│✘╃。

3.尿液✘₪╃☁：用無菌管收集☁╃，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）·│✘╃。仔細收集上清☁╃，儲存過程中如有沉澱形成☁╃，應再次離心·│✘╃。胸腹水▩▩•、腦脊液參照實行·│✘╃。

4.細胞培養上清✘₪╃☁：檢測分泌性的成份時☁╃，用無菌管收集·│✘╃。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）·│✘╃。仔細收集上清·│✘╃。檢測細胞內的成份時☁╃，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液☁╃，細胞濃度達到100萬/ml左右·│✘╃。透過反覆凍融☁╃，以使細胞破壞並放出細胞內成份·│✘╃。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）·│✘╃。仔細收集上清·│✘╃。儲存過程中如有沉澱形成☁╃，應再次離心·│✘╃。

5.組織標本✘₪╃☁：切割標本後☁╃，稱取重量·│✘╃。加入一定量的PBS☁╃，PH7.4·│✘╃。用液氮迅速冷凍儲存備用·│✘╃。標本融化後仍然保持2-8℃的溫度·│✘╃。加入一定量的PBS（PH7.4）☁╃，用手工或勻漿器將標本勻漿充分·│✘╃。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）·│✘╃。仔細收集上清·│✘╃。分裝後一份待檢測☁╃，其餘冷凍備用·│✘╃。

操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣✘₪╃☁：在酶標包被板上設標準品孔10孔☁╃，在▩▩•、第二孔中分別加標準品100μl☁╃，然後在▩▩•、第二孔中加標準品稀釋液50μl☁╃，混勻；然後從孔▩▩•、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔☁╃，再在第三▩▩•、第四孔分別加標準品稀釋液50μl☁╃，混勻；然後在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉☁╃，再各取50μl分別加到第五▩▩•、第六孔中☁╃，再在第五▩▩•、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul☁╃，混勻；混勻後從第五▩▩•、第六孔中各取50μl分別加到第七▩▩•、第八孔中☁╃，再在第七▩▩•、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl☁╃，混勻後從第七▩▩•、第八孔中分別取50μl加到第九▩▩•、第十孔中☁╃，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl☁╃，混勻後從第九第十孔中各取50μl棄掉·│✘╃。（稀釋後各孔加樣量都為50μl☁╃，濃度分別為150ng/L☁╃，100ng/L ☁╃，50ng/L☁╃，25ng/L☁╃，12.5ng/L）·│✘╃。
2. 加樣✘₪╃☁：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑☁╃，其餘各步操作相同）▩▩•、待測樣品孔·│✘╃。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl☁╃，然後再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）·│✘╃。加樣將樣品加於酶標板孔底部☁╃，儘量不觸及孔壁☁╃，輕輕晃動混勻·│✘╃。
3. 溫育✘₪╃☁：用封板膜封板後置37℃溫育30分鐘·│✘╃。
4. 配液✘₪╃☁：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋後備用·│✘╃。
5. 洗滌✘₪╃☁：小心揭掉封板膜☁╃，棄去液體☁╃，甩幹☁╃，每孔加滿洗滌液☁╃，靜置30秒後棄去☁╃，如此重複5次☁╃，拍幹·│✘╃。
6. 加酶✘₪╃☁：每孔加入酶標試劑50μl☁╃，空白孔除外·│✘╃。
7. 溫育✘₪╃☁：操作同3·│✘╃。
8. 洗滌✘₪╃☁：操作同5·│✘╃。
9. 顯色✘₪╃☁：每孔先加入顯色劑A50μl☁╃，再加入顯色劑B50μl☁╃，輕輕震盪混勻☁╃，37℃避光顯色15分鐘.
10. 終止✘₪╃☁：每孔加終止液50μl☁╃，終止反應（此時藍色立轉黃色）·│✘╃。
11. 測定✘₪╃☁：以空白空調零☁╃，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）·│✘╃。 測定應在加終止液後15分鐘以內進行·│✘╃。

注意事項✘₪╃☁：

1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘後方可使用☁╃，酶標包被板開封后如未用完☁╃，板條應裝入密封袋中儲存·│✘╃。
2. 濃洗滌液可能會有結晶析出☁╃，稀釋時可在水浴中加溫助溶☁╃，洗滌時不影響結果·│✘╃。
3. 各步加樣均應使用加樣器☁╃，並經常校對其準確性☁╃，以避免試驗誤差·│✘╃。一次加樣時間控制在5分鐘內☁╃，如標本數量多☁╃，推薦使用排槍加樣·│✘╃。
4. 請每次測定的同時做標準曲線☁╃，然後做復孔·│✘╃。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大於標準品孔孔的OD值）☁╃，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測定☁╃，計算時請後乘以總稀釋倍數（×n×5）·│✘╃。
5. 封板膜只限一次性使用☁╃，以避免交叉汙染·│✘╃。
6. 底物請避光儲存·│✘╃。
7. 嚴格按照說明書的操作進行☁╃，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8. 所有樣品☁╃，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理·│✘╃。
9. 本試劑不同批號組分不得混用·│✘╃。

 10. 如與英文說明書有異☁╃，以英文說明書為準·│✘╃。

計算✘₪╃☁：

   以標準物的濃度為橫座標☁╃，OD值為縱座標☁╃，在座標紙上繪出標準曲線☁╃，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線迴歸方程式☁╃，將樣品的OD值代入方程式☁╃，計算出樣品濃度☁╃，再乘以稀釋倍數☁╃，即為樣品的實際濃度·│✘╃。

試劑盒效能✘₪╃☁：

1.樣品線性迴歸與預期濃度相關係數R值為0.95以上·│✘╃。

2.批內與批間應分別小於9%和11%

檢測範圍✘₪╃☁： 

6ng/L -200ng/L                           

儲存條件及有效期✘₪╃☁：

1.試劑盒儲存✘₪╃☁：；2-8℃·│✘╃。

2．有效期✘₪╃☁：6個月