大鼠蛋白質修補同系物（PTCH)酶聯免疫

     檢測試劑盒使用說明書        AE91758Ra

   使用前仔細閱讀本說明書·◕☁。本酶聯免疫試劑盒是基於雙抗體夾心技術原理╃▩☁││，來檢測大鼠蛋白質修補同系物（PTCH)╃▩☁││，只能用於研究用途╃▩☁││，不得用於醫學診斷·◕☁。

用   途╃│•✘：用於大鼠血清₪✘、血漿及相關液體樣本中蛋白質修補同系物（PTCH)測定·◕☁。

工作原理:

本試劑盒採用的是生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定樣品中大鼠蛋白質修補同系物（PTCH)水平·◕☁。向預先包被了大鼠蛋白質修補同系物（PTCH)單克隆抗體的酶標孔中加入大鼠蛋白質修補同系物（PTCH)╃▩☁││，溫育；溫育後╃▩☁││，加入生物素標記的抗蛋白質修補同系物（PTCH)抗體·◕☁。再與鏈黴親和素-HRP結合╃▩☁││，形成免疫複合物╃▩☁││，再經過溫育和洗滌╃▩☁││，去除未結合的酶╃▩☁││，然後加入底物A₪✘、B╃▩☁││，產生藍色╃▩☁││，並在酸的作用下轉化成終的黃色·◕☁。顏色的深淺與樣品中大鼠蛋白質修補同系物（PTCH)的濃度呈正相關·◕☁。

試劑盒組成 

需要而未提供的試劑和器材

1. 37℃恆溫箱·◕☁。
2. 標準規格酶標儀·◕☁。
3. 精密移液器及一次性吸頭
4. 蒸餾水╃▩☁││，
5. 一次性試管
6. 吸水紙

注意事項

1. 從2-8℃取出的試劑盒╃▩☁││，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘·◕☁。酶標包被板開封后如未用完╃▩☁││，板條應裝入密封袋中儲存·◕☁。
2. 各步加樣均應使用加樣器╃▩☁││，並經常校對其準確性╃▩☁││，以避免試驗誤差
3. 嚴格按照說明書的操作進行╃▩☁││，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
4. 為避免交叉汙染╃▩☁││，要避免重複使用手中的吸頭和封板膜·◕☁。
5. 不用的其它試劑應包裝好或蓋好·◕☁。不同批號的試劑不要混用·◕☁。保質前使用·◕☁。
6. 底物B對光敏感╃▩☁││，避免長時間暴露於光下·◕☁。

洗板方法

手工洗板方法╃│•✘：甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙╃▩☁││，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋後的洗滌液至少0.35ml注入孔內╃▩☁││，浸泡1-2分鐘·◕☁。根據需要╃▩☁││，重複此過程數次·◕☁。

自動洗板╃│•✘：如果有自動洗板機╃▩☁││，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中

標本要求 

1．不能檢測含NaN3的樣品╃▩☁││，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性·◕☁。

2．標本採集後儘早進行提取╃▩☁││，提取按相關文獻進行╃▩☁││，提取後應儘快進行實驗·◕☁。若不能馬上進行試驗╃▩☁││，可將標本放於-20℃儲存╃▩☁││，但應避免反覆凍融·◕☁。

操作程式

1. 標準品的稀釋╃│•✘：(本試劑盒提供原倍標準品一支╃▩☁││，使用者可按照下列圖表在小試管中進行稀釋·◕☁。)

   800 ng/L	5號標準品	120μl的原倍標準品加入120μl標準品稀釋液
   400 ng/L	4號標準品	120μl的5號標準品加入120μl標準品稀釋液
   200 ng/L	3號標準品	120μl的4號標準品加入120μl標準品稀釋液
   100 ng/L	2號標準品	120μl的3號標準品加入120μl標準品稀釋液
   50 ng/L	1號標準品	120μl的2號標準品加入120μl標準品稀釋液

2. 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數·◕☁。每個標準品和空白孔建議做復孔·◕☁。每個樣品根據自己的數量來定╃▩☁││，能使用復孔的儘量做復孔·◕☁。
3. 加樣╃│•✘：1）空白孔╃▩☁││，空白對照孔不加樣品╃▩☁││，生物素標記的抗PTCH抗體╃▩☁││，鏈黴親和素-HRP╃▩☁││，只加顯色劑A&B和終止液╃▩☁││，其餘各步操作相同；2）標準品孔╃│•✘：加入標準品50ul╃▩☁││，鏈黴親和素-HRP50ul(標準品中已事先整合好生物素抗體╃▩☁││，故不加)；3）待測樣品孔╃│•✘：加入樣本40ul╃▩☁││，然後各加入抗PTCH抗體10ul₪✘、鏈黴親和素-HRP50ul╃▩☁││，蓋上封板膜╃▩☁││，輕輕震盪混勻╃▩☁││，37℃溫育60分鐘·◕☁。
4. 配液╃│•✘：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋後備用·◕☁。
5. 洗滌╃│•✘：小心揭掉封板膜╃▩☁││，棄去液體╃▩☁││，甩幹╃▩☁││，每孔加滿洗滌液╃▩☁││，靜置30秒後棄去╃▩☁││，如此重複5次╃▩☁││，拍幹·◕☁。
6. 顯色╃│•✘：每孔先加入顯色劑A50ul╃▩☁││，再加入顯色劑B50μl╃▩☁││，輕輕震盪混勻╃▩☁││，37℃避光顯色15分鐘. 
7. 終止╃│•✘：每孔加終止液50μl╃▩☁││，終止反應（此時藍色立轉黃色）·◕☁。
8. 測定╃│•✘：以空白空調零╃▩☁││，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）·◕☁。 測定應在加終止液後10分鐘以內進行·◕☁。
9. 根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線迴歸方程╃▩☁││，再根據樣品的OD值在迴歸方程上計算出對應的樣品濃度·◕☁。也可以使用各種應用軟體來計算·◕☁。

操作程式總結╃│•✘：

試劑盒效能╃│•✘：

1.樣品線性迴歸與預期濃度相關係數R值為0.92以上·◕☁。

2.批內與批間應分別小於9%和15%

檢測範圍╃│•✘：

檢測範圍╃│•✘：25 ng/L -900 ng/L

儲存條件及有效期╃│•✘：

儲存╃│•✘：2-8℃·◕☁。

有效期╃│•✘：6個月(2-8℃)·◕☁。