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雌二醇的製備方法
  • 釋出日期☁☁:2022-11-17      瀏覽次數☁☁:155
    • 製備方法☁☁:

      採用人骨髓來源細胞使用化合物三甲基膽蒽(MCA)誘導產生並篩選出細胞▩╃,並使用該細胞在體外合成性雌二醇;所述細胞已由中國典型培養物保藏中心保藏▩╃,保藏號CCTCC C2012173;

      製備步驟為☁☁:

      1)人骨髓來源細胞(HMBDCs▩╃,主要成分為人骨髓間充質幹細胞)採用現有技術(本實施例採用骨髓沖洗│☁、貼壁法)進行原代培養製備▩╃,製備的細胞培養於含15%胎牛血清的DMEM培養基▩╃,培養條件為37℃▩╃,5%CO2▩╃,直至105個細胞/培養瓶;

      2)培養基中加入MCA▩╃,使其終濃度為1ug/ml▩╃,並每星期更換含MCA的培養基2次;MCA處理1周後結束;細胞在37℃▩╃,5%CO2環境中▩╃,持續常規培養;

      3)培養至3個月▩╃,培養物中可見細胞中出現生殖細胞樣細胞;上述生殖細胞樣細胞表達生殖細胞的標誌物☁☁:Oct4│☁、Nanos3│☁、c-Kit│☁、DAZL│☁、Vasa;

      4)培養液中檢測到雌二醇的持續表達▩╃,與未經誘導處理hBMDCs(E2=65±14.8pmol/L▩╃, n=6)相比▩╃,MCA誘導後hBMDCs中(E2=3243±947 pmol/L▩╃, n=6)雌二醇的濃度高達50倍(p<0.01)差異有顯著性;重新傳代後▩╃,觀察到隨著培養時間的延長▩╃,雌二醇濃度進行性增加▩╃,傳代培養至10天左右達到高峰▩╃,高達4500pmol/L▩╃,隨後逐步下降▩╃,最終維持到較高水平;

      5)體內雌二醇是由卵巢中卵泡合成▩╃,在體外培養的誘導後hBMDCs中▩╃,觀察到卵泡樣結構的形成(為誘導後hBMDCs中產生雌激素提供細胞支援);卵母細胞的發育需雌二醇的促進▩╃,若缺乏雌二醇▩╃,卵母細胞的最大隻能長到25微米;而誘導後hBMDCs中的卵母細胞樣細胞體積達到40-50微米;免疫熒光證實上述大細胞為卵母細胞;

      6)卵泡相關基因▩╃,包括雌二醇合成的關鍵性基因☁☁:STAR│☁、p450arom│☁、p450c17▩╃,以及卵泡發育相關基因GDF9在培養物中表達(進一步支援誘導後hBMDCs具有合成雌二醇的能力);

      7)最佳化培養條件▩╃,增加雌二醇產生的能力▩╃,並降低培養液中血清的濃度(有利於雌二醇的進一步分離純化);上述生殖細胞樣細胞可進一步增大產生早期卵泡樣結構和卵母細胞樣細胞;

      8)按現有方法分離│☁、純化▩╃,製得雌二醇◕╃•☁。

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