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DNA提取試劑盒的幾種提取步驟
  • 釋出日期·✘•◕✘:2022-11-14      瀏覽次數·✘•◕✘:287
    • DNA提取試劑盒是根據氯/化/芐法構建的╃₪✘│₪,能夠從樣本中提取基因組DNA的試劑盒▩₪│☁✘。氯/化/苄具有能將含有纖維素等的細胞壁中的羥基苄基化╃₪✘│₪,從而破壞細胞壁的特性▩₪│☁✘。本製品利用了氯/化/苄的這一特性╃₪✘│₪,將植物樣品凍結融解後╃₪✘│₪,再使用Pipet Tip的尖//端將植物樣品在Microtube壁上數次按壓即可破壞細胞壁▩₪│☁✘。本法與傳統方法相比╃₪✘│₪,省去了液氮研磨等煩瑣步驟╃₪✘│₪,有利於一次性處理大量樣品▩₪│☁✘。而且╃₪✘│₪,本製品經過了改良╃₪✘│₪,熱處理時間只需15分鐘╃₪✘│₪,使用本製品從實驗開始至水相回收只需30分鐘時間▩₪│☁✘。得到的基因組DNA可以進行PCR擴增及限制酶處理等▩₪│☁✘。

      操作方法·✘•◕✘:
      全套操作約需1小時╃₪✘│₪,分勻漿╃✘、細胞裂解╃✘、除蛋白╃✘、DNA純化等步驟╃₪✘│₪,詳細說明如下▩₪│☁✘。
      勻漿和細胞裂解╃₪✘│₪,使用不同的實驗材料需採用不同的勻漿步驟╃₪✘│₪,具體說明如下·✘•◕✘:

      【從動物組織中提取基因組DNA】
      使用研缽進行勻漿時·✘•◕✘:
      ① 取1~100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的研缽中╃₪✘│₪,快速用力展研成勻漿▩₪│☁✘。
      注)下列組織請加液氮研磨至粉末狀▩₪│☁✘。
      A.富含DNA酶的胰臟╃✘、脾臟╃✘、胸腺╃✘、淋巴等組織▩₪│☁✘。
      B.富含膠原蛋白的皮膚╃✘、肌腱等組織▩₪│☁✘。
      C.富含角質蛋白的組織或堅硬的組織(如骨骼)等▩₪│☁✘。
      ② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1╃₪✘│₪,溫和研磨30秒鐘▩₪│☁✘。
      注)使用上述①-注)的實驗材料時╃₪✘│₪,請在加入Solution A及RNase A1後╃₪✘│₪,將研缽置於65℃水浴上研磨1分鐘▩₪│☁✘。
      ③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿液移至Collection Tube中▩₪│☁✘。如果勻漿體積不足650 μl╃₪✘│₪,請補充Solution A至650 μl╃₪✘│₪,65℃保溫5分鐘▩₪│☁✘。
      使用研磨棒進行勻漿時:
      ① 取1~100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的Collection Tube 中╃₪✘│₪,用研磨棒快速研磨成糊狀▩₪│☁✘。
      ② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1後用研磨棒快速研磨成勻漿▩₪│☁✘。
      ③ 加入350 μl的Solution A將研磨棒上的勻漿衝入Collection Tube中╃₪✘│₪,充分振盪混合後╃₪✘│₪,65℃保溫5分鐘▩₪│☁✘。

      【從植物材料或植物培養細胞中提取基因組DNA】
      ① 按下表稱取適量的新鮮植物材料(如選用的是冷凍乾燥植物材料╃₪✘│₪,則用量減半)╃₪✘│₪,剪成小塊放入研缽中╃₪✘│₪,加入液氮╃₪✘│₪,待樣品冷凍後快速╃✘、用力研磨至粉末狀▩₪│☁✘。研磨時應間斷加入液氮以防止材料融化▩₪│☁✘。
      * 如選取植物的根╃✘、種子等樣品時╃₪✘│₪,因其基因組DNA含量很低╃₪✘│₪,需使用超過表格中所示的引數用量╃₪✘│₪,此時請分兩管進行步驟1~6的實驗操作╃₪✘│₪,在步驟7的操作中再將各管溶液分次加入至同一Spin Column中過濾╃₪✘│₪,使各管的基因組DNA結合到同一個Spin Column上▩₪│☁✘。
      如從培養的植物細胞中提取基因組DNA╃₪✘│₪,請離心收集2×103~1×107的培養植物細胞╃₪✘│₪,加入150 μl水充分懸浮細胞後移入研缽中╃₪✘│₪,加入液氮後快速╃✘、用力研磨至粉末狀▩₪│☁✘。
      注)樣品研磨應充分╃₪✘│₪,否則將會嚴重影響基因組DNA的收率▩₪│☁✘。
      ② 將研缽移至65℃水浴╃₪✘│₪,當樣品粉末剛開始融化時╃₪✘│₪,向研缽中加入700 μl的Solution A和1.2 μl的RNase A1╃₪✘│₪,用力碾磨30秒▩₪│☁✘。
      ③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿移至Collection Tube中▩₪│☁✘。如勻漿體積不足650 μl╃₪✘│₪,請補充Solution A至650 μl▩₪│☁✘。65℃保溫15分鐘▩₪│☁✘。
      注)處理富含纖維的根/莖等植物材料或富含澱粉╃✘、蛋白質的種子等時╃₪✘│₪,可延長水浴時間至60分鐘▩₪│☁✘。

      【從全血中提取基因組DNA】
      ① 取10~250 μl的全血(含抗凝劑)加入至Collection Tube中▩₪│☁✘。
      ② 加入500 μl的Solution A▩₪│☁✘。
      ③ 加入1 μl的RNase A1╃₪✘│₪,激烈振盪15秒鐘後╃₪✘│₪,冰浴5分鐘▩₪│☁✘。
      注) 人與動物的抗凝全血的一次處理量為≤250 μl;禽類╃✘、兩棲類的抗凝全血的一次處理量為≤10 μl▩₪│☁✘。

      【從培養細胞中提取基因組DNA】
      一╃✘、使用懸浮培養的動物細胞時·✘•◕✘:
      ① 使用Collection Tube收集1×105~1.5×107的細胞懸浮液╃₪✘│₪,5,000 rpm離心5分鐘╃₪✘│₪,棄上清(細胞培養液)▩₪│☁✘。
      ② 加入150 μl的滅菌蒸餾水或PBS懸浮細胞▩₪│☁✘。
      ③ 加入500 μl的Solution A和0.8 μl的RNase A1╃₪✘│₪,激烈振盪15秒鐘╃₪✘│₪,然後室溫靜置1分鐘▩₪│☁✘。
      二╃✘、使用貼壁細胞時·✘•◕✘:
      ① 棄盡培養液╃₪✘│₪,向培養皿中加入650 μl的Solution A╃₪✘│₪,室溫靜置1分鐘▩₪│☁✘。
      注)96孔板等的每個孔中一次容納不了650 μl 溶液時╃₪✘│₪,請分數次處理細胞▩₪│☁✘。
      ② 用移液槍的槍頭吹落貼壁培養細胞╃₪✘│₪,取650 μl的細胞懸浮液轉移至Collection Tube中▩₪│☁✘。
      ③ 加入0.8 μl的RNase A1╃₪✘│₪,激烈振盪15秒鐘╃₪✘│₪,然後室溫靜置1分鐘▩₪│☁✘。
      2. 加入400 μl的Solution B╃₪✘│₪,振盪混合▩₪│☁✘。
      3. 加入1 ml的4℃預冷的Solution C╃₪✘│₪,充分混勻後╃₪✘│₪,12,000 rpm離心2分鐘▩₪│☁✘。
      4. 棄去上層有機相╃₪✘│₪,再加入1 ml的4℃預冷的Solution C╃₪✘│₪,充分混勻後╃₪✘│₪,12,000 rpm離心2分鐘▩₪│☁✘。
      5. 棄去上層有機相╃₪✘│₪,然後將水相溶液(無色下層)轉移至置於Collection Tube上的Filter Cup中╃₪✘│₪,12,000 rpm離心1分鐘▩₪│☁✘。
      注)有機相(上層)帶有顏色╃₪✘│₪,請務必除盡╃₪✘│₪,否則會阻礙DNA結合到DNA製備膜上▩₪│☁✘。相間沉澱不必考慮╃₪✘│₪,在過濾時將被去除▩₪│☁✘。
      6. 棄Filter Cup╃₪✘│₪,在濾液中加入400 μl的DB Buffer╃₪✘│₪,混合均勻▩₪│☁✘。
      7. 將試劑盒中的Spin Column安置於Collection Tube上▩₪│☁✘。將上述操作6混合溶液轉移至Spin Column中╃₪✘│₪,12,000 rpm離心1分鐘╃₪✘│₪,棄濾液▩₪│☁✘。
      8. 將500 μl的Rinse A加入至Spin Column中╃₪✘│₪,12,000 rpm離心30秒鐘╃₪✘│₪,棄濾液▩₪│☁✘。
      9. 將700 μl的Rinse B加入至Spin Column中╃₪✘│₪,12,000 rpm離心30秒鐘╃₪✘│₪,棄濾液▩₪│☁✘。
      注)請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B╃₪✘│₪,這樣有助於沖洗沾附於管壁上的鹽份▩₪│☁✘。
      10. 重複操作步驟9▩₪│☁✘。
      11. 將Spin Column安置於新的1.5 ml的離心管上╃₪✘│₪,在Spin Column膜的中央處加入50~200 μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer╃₪✘│₪,室溫靜置1分鐘▩₪│☁✘。
      注)把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至65℃使用時有利於提高洗脫效率▩₪│☁✘。
      12. 12, 000 rpm離心1分鐘洗脫DNA▩₪│☁✘。

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