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化學發光底物的原理與用途
  • 釋出日期☁│:2022-08-01      瀏覽次數☁│:41
    •        辣根過氧化酶使試劑中的發光物(luminol)氧化併發光·✘,而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍✘✘✘·。在免疫印跡中·✘,將複雜的蛋白混合物經sds-page分離·✘,並轉移到固相膜上(如nc₪╃、pvdf)等·✘,用於免疫學檢測·✘,經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接(標記一抗)或間接(標記二抗)反應✘✘✘·。

       原理

       辣根過氧化酶使試劑中的發光物(luminol)氧化併發光·✘,而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍✘✘✘·。在免疫印跡中·✘,將複雜的蛋白混合物經sds-page分離·✘,並轉移到固相膜上(如nc₪╃、pvdf)等·✘,用於免疫學檢測·✘,經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接(標記一抗)或間接(標記二抗)反應✘✘✘·。當加入免疫印跡化學發光試劑後·✘,luminol發生氧化降解·✘,併發射波長為428nm的光·✘,此光可經x光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來✘✘✘·。

      用途

      非放射性發光系統·✘,用於檢測固定在膜上的蛋白·✘,其敏感性達1-5pg✘✘✘·。用x光片可快速地獲得永.久的硬複製結果✘✘✘·。所含獨.特的底物足以維持12小時以上的發光·✘,便於反覆曝光操作·✘,免疫印跡膜經抗體脫卸處理後可供再次抗體探查使用✘✘✘·。適用於痕量蛋白或核酸檢測✘✘✘·。

      使用方法

      1. 印跡膜製備 按常規方法完成SDS-PAGE和電轉膜操作·✘,適當的封閉非常重要✘✘✘·。可以透過標記一抗或二抗的手段引入HRP·✘,一般採用市售的HRP二抗交聯物✘✘✘·。仔細地淋洗對於降低背景非常重要·✘,在與HRP交聯物溫育後·✘,膜片更需仔細洗滌·✘,所有步驟均在室溫下完成✘✘✘·。

      2. 化學發光試劑的配置 在使用前等量混合a液和b液·✘,混合後儘快使用✘✘✘·。將膜片置混合液中於室溫下振盪溫育2分鐘·✘,每平方釐米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片✘✘✘·。
      3.蛋白訊號顯現
      1). 用平頭鑷鉗住膜片·✘,垂直置於吸水紙以吸去過量試劑✘✘✘·。
      2). 置膜片於二層保鮮膜之間·✘,小心趕盡氣泡✘✘✘·。
      3). 將膜片吸附蛋白麵朝上·✘,置於x光片盒中✘✘✘·。
      4). 於暗室中壓上x光片✘✘✘·。
      5).根據訊號的強弱適當調整曝光時間·✘,一般為1min或5min·✘,也可選擇不同時間多次壓片·✘,以達最佳效果✘✘✘·。顯影沖洗✘✘✘·。
      6). 調節曝光時間·✘,再次曝光顯影✘✘✘·。
      4₪╃、膜的重複使用☁│:
      配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液·✘,膜放入後·✘,70?c振盪水浴30分鐘✘✘✘·。再用tbst或pbst緩衝液洗脫·✘,最後用bsa(牛血清白蛋白)或牛奶封閉✘✘✘·。


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