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膠原蛋白怎樣提取與分離◕▩◕?
  • 釋出日期↟↟│✘:2022-07-26      瀏覽次數↟↟│✘:95
    • 膠原蛋白是生物高分子╃·,動物結締組織中的主要成分╃·,也是哺乳動物體內含量最多·│◕、分佈最.廣的功能性蛋白╃·,佔蛋白質總量的25%~30%╃·,某些生物體甚至高達80%以上◕│╃✘。
      畜禽源動物組織是人們獲取天然膠原蛋白及其膠原肽的主要途徑╃·,但由於相關畜類疾病和某些宗教信仰限制了人們對陸生哺乳動物膠原蛋白及其製品的使用╃·,現今正在逐步轉向海洋生物中開發◕│╃✘。歐洲食品安全域性(EFSA)已證實了即使是動物骨骼來源的膠原蛋白也不存在感染瘋牛病和其它相關疾病的可能◕│╃✘。 
      由於氨基酸組成和交聯度等方面的差異╃·,使得水產動物尤其是其加工廢棄物——皮·│◕、骨·│◕、鱗中所含有的豐富的膠原蛋白具有很多牲畜膠原蛋白所沒有的優點╃·,另外來源於海洋動物的膠原蛋白在一些方面明顯優於陸生動物的膠原蛋白╃·,比如具有低抗原性·│◕、低過敏性等特性◕│╃✘。因此水產膠原蛋白可能逐步替代陸生動物膠原蛋白◕│╃✘。 
      膠原蛋白種類較多╃·,常見型別為Ⅰ型·│◕、Ⅱ型·│◕、Ⅲ型·│◕、Ⅴ型和Ⅺ型◕│╃✘。
      膠原蛋白因具有良好的生物相容性·│◕、可生物降解性以及生物活性╃·,因此在食品·│◕、醫藥·│◕、組織工程·│◕、化妝品等領域獲得廣泛的應用◕│╃✘。 

      提取與分離

      由於膠原是細胞外間質成分╃·,在體內以不溶性大分子結構存在╃·,並與蛋白多糖·│◕、糖蛋白等結合在一起╃·,因此膠原的製備包括材料的選擇·│◕、預處理·│◕、酸鹼酶鹽水法提取·│◕、不同型別膠原的分離和純化◕│╃✘。 

      預處理
      除膠原蛋白外╃·,動物骨中還含有油脂·│◕、多種礦物質和其他雜質╃·,因此在被用於提取膠原蛋白之前必須進行預處理◕│╃✘。先剔除動物骨上殘留的肉質和肌腱等雜物╃·,粉碎後用正丁醇或正己烷萃取出骨油◕│╃✘。最後除去骨中無機物以提高膠原蛋白的得率◕│╃✘。除去骨中的礦物質可用稀酸或EDTA溶液◕│╃✘。有人用原料用5倍質量的1.0moL/LHCL脫鈣處理2d╃·,用正乙烷脫脂後再用胃蛋白酶酶解╃·,在加酶量150U/g╃·,pH值1.7╃·,37℃條件下處理120min╃·,然後在固液比1∶6的情況下抽提5h╃·,在此條件下╃·,提取率可達18%;還有人用EDTA溶液(pH7.4)浸泡骨料5d╃·,可有效脫去骨料中的羥基磷灰石◕│╃✘。 
      膠原蛋白的提取一般有三種方法↟↟│✘:一是高壓輔助的物理方法;二是用溶劑預處理結合低溫或熱水抽提的化學方法╃·,根據溶劑的不同╃·,可分為熱水浸提法·│◕、酸法·│◕、鹼法·│◕、鹽法;三是用酶的生物化學法◕│╃✘。一般來說╃·,高壓輔助和熱水抽提針對明膠的提取╃·,而低溫抽提和酶法針對膠原的提取╃·,但其基本原理都是根據膠原蛋白的特性改變蛋白質所在的外界環境╃·,把膠原蛋白從其他蛋白質中分離出來◕│╃✘。 
      在實際提取過程中╃·,不同提取方法之間往往相互結合╃·,可以得到較好的提取效果◕│╃✘。採用超高壓處理系統對原料給予高壓處理一段時間╃·,使其組織結構和膠原蛋白的三股螺旋結構發生鬆弛·│◕、變性╃·,便於分離提取◕│╃✘。 

      熱水提取法是將原料經過除雜蛋白等前處理之後╃·,在一定條件下直接用熱水浸提已經變性了的膠原蛋白或膠原蛋白水解物╃·,使用的溫度有100℃沸水浴·│◕、60-70℃·│◕、40-45℃◕│╃✘。

      酸法

      酸法提取是利用一定濃度的酸溶液在一定的條件下提取膠原蛋白╃·,主要採用低離子濃度酸性條件破壞分子間鹽鍵和希夫鹼╃·,而引起纖維膨脹·│◕、溶解╃·,採用酸法提取的膠原蛋白通常成為酸溶性膠原蛋白◕│╃✘。酸溶解法可將沒有交聯的膠原分子溶解出來╃·,也可溶解含有醛胺類交聯鍵的膠原纖維╃·,然後釋放到溶劑中◕│╃✘。酸法是提取膠原蛋白比較常用和有效的方法╃·,用低溫酸法提取的膠原最大.程度的保持了其三螺旋結構╃·,適用於醫用生物材料及原料的製備◕│╃✘。通常的做法是將適當濃度的酸液按一定料液比加入到經過預處理的骨粉中╃·,於0~25℃攪拌提取一定時間◕│╃✘。在採用酸法進行膠原蛋白的提取時╃·,注意提取溫度不宜過高╃·,以免膠原蛋白的生物活性發生破壞◕│╃✘。取樣經前處理後╃·,勻漿在低溫下用酸浸提╃·,離心即可得酸溶性膠原蛋白(acid-soluble collagen╃·,ASC)◕│╃✘。作為溶劑使用的酸╃·,主要有鹽酸·│◕、磷酸·│◕、甲酸·│◕、乙酸·│◕、蘋果酸·│◕、檸檬酸等╃·,但大多數研究集中於乙酸抽提╃·,像Maria Sadowska等用0.5mol/L檸檬酸在室溫下提取骨膠原蛋白╃·,其提取率略低於乙酸提取◕│╃✘。檸檬酸因不產生顏色和異味得以廣泛使用於食品工業的膠原蛋白的提取

      酸法處理時╃·,反應強烈╃·,水解徹底╃·,多生成氨基酸混合物╃·,而且使用酸提取時╃·,根據酸濃度·│◕、水解溫度·│◕、水解時間等條件的不同╃·,可以得到分子量不均的膠原水解物◕│╃✘。但是在即使中等濃度酸徹底水解過程中色氨酸也會全部被破壞╃·,絲氨酸和酪氨酸也會部分被破壞╃·,且裝置腐蝕嚴重◕│╃✘。因此╃·,酸法溶出生物醫用膠原要準確控制酸度·│◕、溫度·│◕、時間等影響因素◕│╃✘。由於各種不足╃·,酸法很少單獨使用╃·,一般和酶法配合◕│╃✘。比如以豬皮為原料╃·,在檸檬酸(pH8.6)和胃蛋白酶協同下提取膠原蛋白◕│╃✘。在處理後的豬皮中加0.05moL/L含有胃蛋白酶的檸檬酸溶液(pH2.5-3)處理一段時間╃·,然後再用NaCL鹽析╃·,最後提取率為12.35%╃·,提取物保持了完整三股螺旋結構的I型膠原蛋白◕│╃✘。還有人以雛雞胸軟骨為原材料╃·,在0.5moL/L醋酸條件下經胃蛋白酶多次消化╃·,在4℃╃·,20000r條件下離心20min╃·,最後應用DEAE-Sephadex A-50進行離子交換層析╃·,之後透析╃·,再用NaCL鹽析╃·,最後得到純化的膠原蛋白Ⅱ型◕│╃✘。

      鹼法

      鹼法提取即利用一定濃度的鹼在一定的外界條件下提取膠原蛋白╃·,鹼處理法中常用的處理劑為石灰·│◕、氫氧化鈉·│◕、碳酸鈉等╃·,用氫氧化鈉浸提時效果較好◕│╃✘。一般的是把樣品勻漿後╃·,用鹼溶液多次溶脹後╃·,再離心提取◕│╃✘。但由於易引起蛋白質變性╃·,如膠原肽鍵水解╃·,含羥基·│◕、疏基的氨基酸全部被破壞;所得產物等電點pH值較低╃·,天冬酞胺和谷氨酞胺分別轉變為天冬氨酸和穀氨酸╃·,得到的水解產物分子量較在酸性溶液中比低等問題╃·,若比較嚴重的話╃·,還會產生D·│◕、L-型氨基酸消旋混合物╃·,若D型氨基酸含量高過L 型氨基酸╃·,則會抑制L-型氨基酸的吸收╃·,有些D型氨基酸有毒╃·,甚至有致癌·│◕、致畸和致突變的作用◕│╃✘。而且鹼法提取的含量較低╃·,用氫氧化鈉從魷魚皮中提取鹼溶性膠原蛋白╃·,其得率只有3%(以溼

      基計)◕│╃✘。所以╃·,若想提取結構完整·│◕、使用安全的膠原蛋白╃·,很少採用此方法◕│╃✘。有關單獨採用鹼法提取膠原蛋白的報道不多╃·,一般是鹼法提取和酸法提法結合使用◕│╃✘。比如在4℃條件下╃·,魚骨用0.1moL/L的NaOH浸泡6h╃·,再用2.5%NaCl浸泡6h去除雜蛋白╃·,用10%的異丙醇溶液去除脂肪╃·,0.1moL/L的檸檬酸浸泡3d╃·,最後得到無色無味的膠原蛋白╃·,提取率為11.87%◕│╃✘。 
      注意╃·,無論酸法或鹼法╃·,均可有效地提取膠原蛋白╃·,有人分別採用醋酸- 鹽酸的混合酸液(pH3.0)和NaOH溶液(pH12.0)提取骨膠原蛋白╃·,提取率基本相當◕│╃✘。但是╃·,這兩種方法提取膠原蛋白不僅容易影響膠原蛋白的生物活性╃·,而且提取後產生的酸性或鹼性廢液必須進行適當處理╃·,以避免對環境造成汙染◕│╃✘。 

      鹽法

      鹽法提取是利用各種不同的鹽在不同的濃度條件下提取鹽溶性膠原蛋白的方法◕│╃✘。常用來提取膠原的鹽有鹽酸-三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl)·│◕、氯化鈉·│◕、檸檬酸鹽等◕│╃✘。在中性條件下╃·,當鹽的濃度達到一定量時╃·,膠原就會溶解在其中╃·,但是膠原的溶解和分級受中性鹽效應影響╃·,有的鹽可提高膠原的穩定性╃·,而有的則可降低其構象穩定性╃·,從而對提取天然膠原蛋白很不利◕│╃✘。此外╃·,可採用不同濃度的氯化鈉對提取的膠原蛋白進行鹽析處理╃·,可以沉澱出不同型別的膠原蛋白◕│╃✘。

      酶法

      酶法提取是指可溶性膠原和酸溶性膠原被提取後╃·,需用一些蛋白酶╃·,如膠原酶·│◕、胃蛋白酶·│◕、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等水解╃·,得到不同的酶促溶性膠原蛋白◕│╃✘。所使用的蛋白酶主要分3種↟↟│✘:動物蛋白酶(如胰蛋白酶╃·,胃蛋白酶)╃·,植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶╃·,菠蘿蛋白酶)╃·,微生物蛋白酶(如鹼性蛋白酶╃·,中性蛋白酶)◕│╃✘。在對酶法水解膠原蛋白的研究中╃·,以鹼性蛋白酶應用最多◕│╃✘。 

      將膠原進行限制性降解╃·,即將末端肽切割下來╃·,由於膠原肽鏈間的共價鍵都是透過分子末端肽裡的賴氨酸或羥賴氨酸的相互作用形成的╃·,末端肽被切下後╃·,含三螺旋結構的主體部分可溶於稀有機酸而被提取出來◕│╃✘。用酶處理╃·,可以水解掉膠原纖維蛋白的末端肽╃·,提高膠原蛋白的產率;而且還不會破壞膠原蛋白的三股螺旋結構╃·,保持其特性◕│╃✘。影響酶提取的因素有很多╃·,如酶濃度·│◕、酶與底物的比例·│◕、酶解時間·│◕、酶解溫度·│◕、pH值以及料液比等◕│╃✘。在實際操作中╃·,大多數採用酶複合法提取膠原蛋白╃·,較多的是使用胃蛋白酶提取╃·,有機酸多為乙酸◕│╃✘。
      酶解膠原蛋白的工藝主要分為單酶水解法和多酶水解法◕│╃✘。多酶水解法又分為混合酶水解法(比如牛胰蛋白酶╃·,鏈黴菌蛋白酶╃·,芽孢桿菌蛋白酶混合)和分步酶水解法╃·,酶法提取皮膠原具體實驗工藝及條件的選取通常應考慮要開發的產品對分子量的要求╃·,要得到分子量較小的膠原多肽一般採用多酶水解法◕│╃✘。影響酶解效果的因素主要有↟↟│✘:酶的種類·│◕、加酶量·│◕、酶解溫度·│◕、酶解時間·│◕、pH值及料水比◕│╃✘。採用酶法提取骨料中的膠原蛋白╃·,既能有效縮短提取時間╃·,又能獲得具有良好生物活性的膠原蛋白╃·,而且對環境的汙染也較小◕│╃✘。膠原蛋白不易被普通蛋白酶水解╃·,但能被動物膠原酶斷裂╃·,斷裂的碎片自動變性後可被普通蛋白酶水解◕│╃✘。胃蛋白酶水解膠原蛋白的適宜條件為pH 1.65~1.70·│◕、溫度37℃◕│╃✘。 
      有人以豬骨為原料╃·,用蛋白酶的酶解反應代替傳統制膠工藝╃·,對骨膠原的酶解反應與酶法制膠工藝進行了試驗研究◕│╃✘。結果表明↟↟│✘:以胃蛋白酶對骨膠原的提取率最高(46.14%)╃·,其次是胰蛋白酶(43.42%)╃·,接下來是中性蛋白酶(30.14%)╃·,最後是鹼性蛋白酶(21.15%)◕│╃✘。並且透過單因素和正交試驗對胃蛋白酶酶解反應中各主要影響因素進行了最佳化◕│╃✘。試驗結果表明╃·,胃蛋白酶提取的最.優條件是╃·,胃蛋白酶的濃度是1%╃·,在pH2.0的條件下酶解48h╃·,然後在濃度為10%(w/v)的NaCL溶液中鹽析24h╃·,最後骨膠原的回收率為64.77%╃·,骨膠原的提取率為49.75%◕│╃✘。還有人用胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白╃·,分別在水解0·│◕、2·│◕、6·│◕、10·│◕、14·│◕、18·│◕、22·│◕、26h時對四種不同胃蛋白酶用量(分別為1%·│◕、2%·│◕、2.5%·│◕、3%)的試樣取樣檢測╃·,採用一階HILL方程模擬胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白的程序以及胃蛋白酶水解速率的衰減過程╃·,最後得出2%的胃蛋白酶用量和6-7h的水解時間提取率最大◕│╃✘。還有人用以新鮮豬皮為原料╃·,在50-52℃的條件下用胰酶進行水解╃·,在酶用量為 5000↟↟│✘:1~10000↟↟│✘:1╃·,pH值為9╃·,反應2-3h╃·,原料↟↟│✘:水為1↟↟│✘:2的條件下酶解◕│╃✘。結果表明↟↟│✘:總蛋白質的提取率≥80%◕│╃✘。 
        採用酶法提取膠原蛋白時╃·,必須嚴格控制提取條件↟↟│✘:
      首先╃·,酶作用時間必須適當◕│╃✘。如果時間過短╃·,膠原蛋白就不能充分釋放到提取液中╃·,影響提取率;如果酶作用時間過長╃·,膠原蛋白會水解過度╃·,產生過多的苦味小分子低聚肽╃·,不僅會增加分離純化的難度╃·,也會影響膠原蛋白的功能特性和生物活性◕│╃✘。
      其次╃·,酶解溫度要適宜◕│╃✘。溫度過低╃·,酶的作用效果不明顯;溫度過高會引起酶的失活和膠原蛋白的變性◕│╃✘。據報道╃·,當介質pH略低於中性時╃·,膠原蛋白的變性溫度為40~41℃╃·,當介質pH為酸性時╃·,膠原蛋白的變性溫度為38~39℃╃·,而且魚皮膠原蛋白的變性溫度要比豬皮膠原蛋白的變性溫度低7~12℃◕│╃✘。所以╃·,如果要使提取的膠原蛋白具有良好的生物活性╃·,在提取過程中應使提取溫度低於變性溫度◕│╃✘。
      第三╃·,需選用適當的酶◕│╃✘。一般從陸生哺乳動物組織中提取膠原蛋白時╃·,採用胃蛋白酶在其最適作用溫度下進行提取是合理的╃·,但對於魚類等水生動物╃·,由於其膠原蛋白的變性溫度比陸生哺乳動物低╃·,因此許多蛋白酶便不適用╃·,如果在這些酶的最適作用溫度下提取可能會破壞膠原蛋白的某些功能特性和生物活性◕│╃✘。採用酶法提取膠原蛋白及其多肽的研究主要是從動物皮及其加工副產物中╃·,應用酶法從動物骨中提取膠原蛋白及其多肽報道較少◕│╃✘。

      純化

      可用於膠原蛋白的純化方法包括鹽析法·│◕、透析法·│◕、離心法·│◕、電泳法和色譜法╃·,其中鹽析法·│◕、離心法和電泳法最為常用◕│╃✘。由於單一方法難以完全分離純化膠原蛋白╃·,實際操作都是透過複合法來達到分離純化膠原蛋白的目的◕│╃✘。鹽析法一般採用高濃度NaCl;離心法常選用製備型低溫超速離心機;電泳法多采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)╃·,該法既可用於膠原蛋白的分離純化╃·,還可用來測定膠原蛋白分子的相對分子質量◕│╃✘。像有人用破碎·│◕、酶解·│◕、鹽析三步法提純蘇尼特羊骨骼I型膠原蛋白◕│╃✘。先去除骨頭裡的非膠原物質╃·,然後往沉澱中10%的胃蛋白酶╃·,在4℃的條件下消化24h╃·,以14000r/min離心40min◕│╃✘。棄沉澱往上清液中加NaCL╃·,使它終濃度達到0.9moL/L╃·,靜置過夜╃·,再離心╃·,最後的沉澱就是I型膠原蛋白◕│╃✘。

        

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