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關於蛋白質綴合的方案你瞭解多少
  • 釋出日期☁•▩·│:2022-05-11      瀏覽次數☁•▩·│:123
    • 關於蛋白質綴合的簡捷方案你瞭解多少▩·☁?以下是使用SMCC和DTT詳細說明PE-蛋白質綴合的方案•│☁,供參考╃·✘·•。
      注意☁•▩·│:該方案使用IgG(MW☁•▩·│:150kDa)作為其綴合蛋白•│☁,但是其他蛋白質可以用適當修飾的量替代╃·✘·•。

      PE準備
      注意☁•▩·│:如果PE作為溶液(通常為硫酸銨)儲存•│☁,則必須首先進行離心分離╃·✘·•。離心並棄去上清液•│☁,然後在PBS中以與原溶液相同的濃度重建沉澱物╃·✘·•。
      如果PE以固體形式儲存•│☁,立即懸浮在PBS中╃·✘·•。
      對於計劃結合的每mg IgG•│☁,使用3.5 mg PE╃·✘·•。
      1.將PE溶液透析•│☁,每1升PE對1升PBS進行透析╃·✘·•。重複一次╃·✘·•。
      2.對每升PE的1升透析緩衝液*透析PE溶液╃·✘·•。
      3.透過測量280,565和620 nm處的吸光度來確保PE溶液的純度╃·✘·•。得到的565 / 620nm讀數大於50的比率是藻藍蛋白去除的指標•│☁,並且565/280比率大於5表明溶液的進一步純度╃·✘·•。

      PE衍生化(SMCC-PE)
      1.在其用於以下步驟和綴合之前•│☁,立即在DMSO中製備10mg / mL SMCC原液╃·✘·•。
      2.每mg PE將11μlSMCC溶液加入到步驟1b產生的PE溶液中╃·✘·•。將溶液包裹在鋁中•│☁,孵育1小時•│☁,旋轉╃·✘·•。
      3.用交換緩衝液*平衡凝膠過濾柱•│☁,並將前一步驟中的衍生化PE透過其上╃·✘·•。

      減少IgG
      1.在蒸餾水中製備1M DTT(15.4 mg /100μl)溶液╃·✘·•。
      2.在4mg / mL或更高的適當緩衝液中製備IgG╃·✘·•。
      3.透過在混合的同時每mL IgG溶液新增20μlDTT原液來產生20mM IgG溶液╃·✘·•。在沒有額外混合的情況下•│☁,站立30╃·✘·•。
      4.用交換緩衝液平衡過濾柱•│☁,並將還原的IgG透過╃·✘·•。從柱中收集0.25mL餾分並以大多數池合併╃·✘·•。
      一旦完成該步驟•│☁,就完成以下結合•│☁,並且完成步驟2(同時)╃·✘·•。

      共軛
      1.每mg還原的IgG溶液加入3.2mg SMCC-PE╃·✘·•。用鋁包裹並在室溫下旋轉1小時╃·✘·•。
      2.準備10 mg NEM在1 mL DMSO中的溶液╃·✘·•。
      3.每mg IgG向IgG溶液中加入34μg╃·✘·•。再次包裹鋁並在室溫下旋轉20分鐘╃·✘·•。
      4.可以將最終溶液透析或在柱上執行到合適的緩衝液中╃·✘·•。
      注意☁•▩·│:不要凍結結合物╃·✘·•。

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